GLP-1(lenke:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-peptide-cas-87805-34-3.html) er et polypeptidhormon som består av 30 aminosyrer. Med den dyptgående forskningen på GLP-1 har flere og flere syntetiske metoder blitt utviklet. Denne artikkelen vil systematisk introdusere de kjente syntesemetodene for GLP-1.
Metode 1, fastfasesyntese:
Fastfasesyntese er en mye brukt metode for peptid- og proteinsyntese, og er også ofte brukt for syntese av GLP-1. Ved fastfasesyntese dannes kjernestrukturen ved å koble den første aminosyren til harpiksen. Deretter tilsettes den neste aminosyren i rekkefølge og omsettes kjemisk med et passende kondenseringsmiddel. Til slutt kan målproduktet oppnås ved å spalte polypeptidet fra harpiksen.
Viktigheten av fastfasesyntese er at den muliggjør automatisering og storskala produksjon av peptidsyntese. De nåværende mainstream solid-fase syntesemetodene inkluderer Fmoc og Boc. Blant dem bruker Fmoc-metoden N-Fmoc-beskyttelsesgruppen for å beskytte peptidet, mens Boc-metoden bruker tert-butyloksykarbonyl for å beskytte karboksylgruppen.
Metode to, væskefasesyntese:
Væskefasesyntese er en tradisjonell metode for peptidsyntese der reaktantene plasseres i væskefasen for reaksjonen. Fordelen med væskefasesyntese er at reaksjonsforholdene er milde og egnet for modifisering av sensitive kjemiske strukturer. På grunn av for mange reaktanter er imidlertid renseprosessen relativt tungvint. Kjemiske reaksjoner i væskefasesyntese inkluderer:
1. Kondensasjonsreaksjon:
Kondensasjonsreaksjon er en av de mest grunnleggende reaksjonene i peptidsyntese, det vil si at karboksylgruppen initiert av kondenseringsmidler som DCC og HOBt er koblet til aminogruppen til aminosyren gjennom acyleringsreaksjon. Reaksjonsbetingelsene er milde og utbyttet er høyt.
2. Eliminasjonsreaksjoner:
Elimineringsreaksjonen er å redusere metioninet til ditiolen med NaBH4 og andre reduksjonsmidler, noe som gjør det inaktivt. Reaksjonen må utføres under grunnleggende betingelser.
3. Fjerning av beskyttelsesgrupper:
På grunn av de ulike funksjonene til aminosyrer i peptidkjeden, vil ulike beskyttelsesgrupper brukes til beskyttelse. Etter at syntesen er fullført, må den beskyttende gruppen fjernes. For Fmoc-metoden brukes piperidin vanligvis for å fjerne Fmoc; mens for Boc-metoden brukes TFA for å fjerne Boc.
Metode tre, kjemisk syntese:
GLP-1 er et polypeptidhormon med viktige biologiske aktiviteter. Syntesen kan realiseres ved forskjellige metoder, blant annet er kjemisk syntese en av de mest brukte metodene. Fordelen med kjemisk syntese er at den kan produsere høyst rene målprodukter, som egner seg for storskala produksjon. Den kjemiske syntesemetoden og detaljerte trinn for GLP-1 vil bli introdusert nedenfor.
1. Syntetisk rute og beskyttelsesgruppevalg:
GLP-1-molekylet består av 36 aminosyrer, inkludert 21 L-type og 15 D-type aminosyrer. Før syntesen utføres, er det nødvendig å velge en passende syntetisk rute og velge den tilsvarende beskyttelsesgruppen i henhold til de syntetiske betingelsene. Fmoc fastfasesyntese brukes vanligvis til automatisert storskalasyntese. Denne metoden bruker N-9-fluoroimido-karboksylbeskyttelse (N-Fmoc) som en beskyttende gruppe, og må også velge en passende sekundær beskyttelsesgruppe (som tert-butyl eller metyl) for å sikre beskyttelse av spesifikke steder. Hver gang en ny aminosyre tilsettes, må Fmoc-beskyttelsesgruppen fjernes først, og deretter tilsettes den beskyttede koblingssubstansen til neste aminosyre.
2. Syntese av kjerneaminosyresekvensen:
Kjernesekvensen til GLP-1 består av 21 aminosyrer, inkludert et nøkkelserin og fire prolylglutaminsyredipeptidsekvenser. I fastfasesyntese kan syntesen av kjernesekvensen deles inn i følgende trinn:
2.1. Tilsett eddiksyrekarbamat (Fmoc-NH-CH2CO2Et) og 2-Cl-Trt-Cl til fastfase syntetisk harpiks, og utfør kondensasjonsreaksjon med DIC/NMM-koblingsmiddel.
2.2. Fjern Fmoc-beskyttende gruppe ved å avbeskytte gruppereaksjonen.
2.3. Legg til neste aminosyre, gjenta trinn 1 og trinn 2 i rekkefølge til kjernesekvensen er syntetisert.
2.4. Dannelse av pentapeptidstrukturer på fastfaseharpiks. Tilsett acetaliseringsreagenset til fastfase-harpiksen, reager med det N-terminale gjenkjennelsesmidlet (som HBTU), tilsett sidekjedebeskyttelsesgruppen til serin som et hjelpereduksjonsmiddel, og fjern deretter Fmoc-beskyttelsesgruppen.
2.5. Under katalyse av Bacillus subtilis-transferase (ProTide) gjennomgår pentapeptidstrukturen en utvekslingsreaksjon med forløperen til serinjodacetat.
3. Syntese av den gjenværende aminosyresekvensen:
Etter å ha fullført syntesen av kjernesekvensen, er det nødvendig å fortsette å legge til de gjenværende aminosyrene, inkludert L- og D-type aminosyrer. Tilsetningen av disse aminosyrene må starte fra kjernesekvensen, legge til den neste aminosyren i sekvensen og bruke det tilsvarende kondenseringsmiddelet til å utføre kjemiske reaksjoner inntil et komplett GLP-1-polypeptidmolekyl er syntetisert. Under denne prosessen er det også nødvendig å velge en passende beskyttelsesgruppe etter behov, og å utføre trinnene med reaksjon, fjerning av beskyttelsesgruppe og tilsetning av aminosyre i rekkefølge.
4. Natriumhydroksidbehandling:
Etter at alle aminosyrene er tilsatt, dannes en ufullstendig syntetisert peptidkjede på fastfase-harpiksen og må behandles for å danne et fullt dannet peptidmolekyl. For det første bør det uformede peptidet hydrolyseres av natriumhydroksid, slik at den C-terminale karboksylgruppen som opprinnelig var festet til harpiksen løsnes fra harpiksen, og den beskyttende gruppen løsnes i vann. Etter hydrolysereaksjon oppnås målproduktet.
5. Nedbør og vasking:
Etter behandlingen behandles den hydrolyserte løsningen med syre for å utfelle målproduktet. Deretter ble pelleten resuspendert i vann, etterfulgt av intensiv vasking for å fjerne urenheter.
6. Rensing:
Det siste trinnet er rensing av det ønskede produktet, vanligvis ved bruk av høyytelses væskekromatografi. Under denne prosessen kan renheten til produktet bestemmes ved å detektere toppen av løsningen i massespekteret. Kort sagt, den kjemiske syntesen av GLP-1 krever flere runder med komplekse reaksjoner og strenge renseprosesser for å endelig oppnå det aktive målproduktet.
Metode fire, biosyntese:
GLP-1 er et viktig polypeptidhormon med ulike fysiologiske effekter, inkludert å fremme insulinsekresjon, undertrykke appetitt, redusere kroppsvekt og opprettholde insulinfølsomhet osv. Biosyntesemetoden til GLP-1 syntetiseres hovedsakelig av L-celler i bukspyttkjertelen, og dens syntesehastighet reguleres med diettinntak. De detaljerte trinnene introduseres som følger:
1. Forberedende arbeid før syntese:
Før biosyntesen av GLP-1 må det gjøres noe forberedende arbeid, inkludert å bestemme celletypen som brukes, sette kulturbetingelsene og velge riktig katalytisk enzym. L-celler er hovedkilden til GLP-1-syntese fordi de inneholder forløpere til to hormoner, GIP (glukagonlignende peptid 1) og GLP-1. L-celler kan isoleres fra tarmepitelet til kaniner eller mus. Før biosyntese må cellene dyrkes til et tilstrekkelig antall, og tilstrekkelig med næringsstoffer og passende dyrkingsforhold bør gis. I tillegg er det nødvendig å velge det passende katalytiske enzymet for å fremme reaksjonen.
2. Syntese og prosessering av forløpere:
Biosyntesen av GLP-1 skjer hovedsakelig i L-celler, og forløperen er sammensatt av to hormoner, GIP og GLP-1. Etter å ha gått inn i endokrine celler, blir GIP og GLP-1 behandlet av proteolytiske enzymer og spaltet til individuelle peptider. En rekke enzymer og kofaktorer er involvert i denne prosessen, inkludert forløper polypeptid acidase (PC2), isomerase og sene adhesjonsfaktorer.
3. Gjensidig konvertering mellom polypeptidsegmenter:
Etter prosessering blir GIP- og GLP-1-peptidene rekombinert for å danne GLP-1-polypeptidet. Denne prosessen krever bruk av glukagonlignende peptid 1 (GLP-1) som en mal som andre individuelle peptider kombineres til for å danne nye sammensatte polypeptider. Denne prosessen krever også noen spesifikke enzymer og faktorer, inkludert Prohormone Convertase 1/3 (PC1/3) og Carboxypeptidase E (CPE).
4. GLP-1 sekresjon:
Etter at GLP-1 er syntetisert og behandlet, lagres det i cytoplasmaet og indre vesikler i endokrine celler. Når de stimuleres av diett, frigjør endokrine celler GLP-1 og kommer inn i blodsirkulasjonen gjennom mikrokar. Denne prosessen er regulert og kontrollert gjennom en rekke signaltransduksjonsveier, inkludert cAMP-Ca2 plussog så videre.
Kort sagt, biosyntesen av GLP-1 involverer felles handling av flere koblinger og faktorer. Kombinasjonen av biosyntese og kjemisk syntese kan gi et bedre grunnlag og støtte for forskning og produksjon av GLP-1.
Metode fem, enzymatisk syntese:
Enzymatisk syntese er syntesen av peptidkjeder gjennom katalyse av biologiske enzymer. Sammenlignet med tradisjonelle væskefasesyntesemetoder, kan enzymatisk syntese utføres ved romtemperatur, og et bredt spekter av råmaterialer kan velges. Enzymer som teta-væskesyntase, AEP, ACE osv. brukes vanligvis for å katalysere syntesen.
Avslutningsvis er de ovennevnte metodene gjennomførbare metoder for GLP-1-syntese. Ulike metoder er egnet for ulike eksperimentelle forhold og farmasøytiske produksjonsmiljøer.